淋球菌如何进行分离培养

　　原理

　　如果标本中有淋球菌，则在合适的培养基上经培养后可长成菌落。各种细菌在培养基上生长成的菌落形态各不相同。根据菌落的大小、表面高起或扁平、光泽、色素和边缘的情况等，作为细菌鉴定的标准。

　　方法

　　1.取材

　　培养要获得成功，取材的部位和方法要准确。由男性病人前尿道取材时，应该用细小棉拭子或藻酸钙拭子或白金耳伸入尿道口2cm～4cm，取出的分泌物应略带粘膜。从女病人的宫颈取材时，应先用温水湿润扩阴器(不要用液体石蜡等润滑油)。应将棉拭插入宫颈口1.5cm处，稍转动并停留10s～30s，让棉拭充分吸附分泌物。从直肠取材时，应将棉拭插入肛门2.5cm以上，如果棉拭碰到粪便，应换一个棉拭重取。检查淋菌性咽炎时，应从扁桃体及扁桃体窝取材。为了提高阳性率，可同时取二份标本进行培养。

　　2.培养基

　　由于淋球菌的营养要求较复杂，所用的培养基中应含有动物蛋白及细菌生长所需的各种因子。目前国内常用的是血液琼脂或巧克力琼脂。为抑制杂菌，在培养基中可加入少量抗菌物质如多粘菌素B(25g/ml)和万古霉素(3.3g/ml)等。所用血液如羊血、兔血和人血均可，浓度为8%～10%.但避免血液中加入抗凝剂等药物。培养基的pH值以7.4为好。目前国外常用的培养基有Thayer-Martin(T-M)培养基、NewYork City(NYC)培养基和Martin-Lewis(ML)培养基等。T-M培养基是在GC基础培养基中，加入血红蛋白(1%)、抗生素(万古霉素3g/ml、粘菌素7.5g/ml和制霉菌素12.5g/ml)和淋球菌增菌剂，使绝大多数杂菌被抑制而淋球菌菌落长得较大，在乎皿中几乎呈纯培养，从而大大提高了由子宫颈、尿道，尤其是咽和直肠部位分离出淋菌的阳性率。

　　3.培养条件

　　淋球菌对外环境变化颇为敏感，对寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，为了保证培养有足够的成功率，取材后应立即接种，标本离体时间越短越好。取材处离实验室距离较远时，应将标本接种于Smart或Amies运送培养基或1%葡萄糖肉浸液中，并注意在运送过程中保温。接种的血平皿应先放在37℃温箱中预温。培养的最适温度为35℃～36℃，超过38.5℃或低于30℃便生长不良。因此，孵育的温度要恒定。淋球菌为需氧菌，但最初从人体分离时，为促进生长，需用5%二氧化碳环境培养。为保持一定的湿度，可在培养缸中放些浸水棉球。

　　结果

　　淋球菌在血平皿上经24h～48h的培养后，可形成圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落。边缘呈花瓣状，直径为0.5mm～1.0mm.用白金耳触之有粘性。如继续培养，菌落面积增大，表面变得粗糙，边缘出现皱缩。若从菌落上取材作涂片，可见到菌的大小及染色的深度有差异，排列也不一致，约有25%的菌为典型的双球菌，其他75%为单球菌、四联形或八叠形。

　　淋球菌在液体培养基中生长于液体表面，或稍有轻度混浊和颗粒沉淀。

　　注意事项

　　1.培养要获得成功，取材是关键之一。取材的深度一定要够，因为淋球菌好发于柱状上皮细胞而不是复层鳞状上皮细胞。男性尿道前端包括舟状窝都为复层鳞状上皮覆盖，所以要深人到尿道内2cm～4cm处，并蘸取少量粘膜，阳性率才高。女性病人取材时，要求将棉拭插入宫颈管，转动并停留10s～30s也是这个道理。有些人只在阴道口取少量分泌物作分离培养，阳性率当然会降低，因为有生活力的菌从宫颈随分泌物由阴道流出需一定时间，阴道内pH值低，又因各种杂菌的作用，到阴道口时淋菌的生活力较低，再加上培养过程中各种因素的影响，培养成功的机会就会减少。

　　2.对症状不典型的男病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后2～3h之后。另外，采样者应熟练掌握前列腺按摩术，必要时作前列腺按摩取材。

　　3.对女性淋病的检查主张用淋球菌培养。国内目前使用血液琼脂加入多粘菌素作抑菌剂效果尚可。但蛋白胨最好用进口的(Oxoid公司产品或日本产或Polypepton等)，并用肉浸液加酵母浸膏等为好。

　　4.国内目前使用的血液琼脂或巧克力琼脂中加人多粘菌素和万古霉素以分别抑制革兰阴性和革兰阳性杂菌。但由于部分淋球菌(某些地区可高达5%)对万古霉素也敏感，因此，最好不用万古霉素。

　　5.淋球菌在血平板上培养24h，虽能见到菌落，但个儿很小，难以辨认其特点。24h～36h，菌落迅速长大。所以观看菌落特征最好在36h左右。超过36h，菌落特征也会有较大的改变。

　　临床意义

　　淋球菌培养用作诊断和某些特殊目的。培养法对男性及女性标本都是适用的，是世界卫生组织推荐的筛查淋病病人的唯一方法，也是诊断淋病的金标准方法。